之一 具有高扩增活性，高热稳定性的反转录酶

  反转录酶，又称逆转录酶，是依赖RNA为模板的DNA聚合酶的统称。美国科学家H.M.Temin和D.Baltimore在1970年发现了反转录酶，并因此获得了1975年的诺贝尔生理学医学奖。反转录酶的发现对遗传工程技术起来到了巨大的推动作用，是研究真核或者原核生物目的基因，构建cDNA文库等实验不可或缺的工具，与Taq酶等共同构成了现代生物技术的的基础工具酶。

        目前已经商品化的反转酶主要有，AMV（avian myeloblastosis virus）和m-mlv（molomey murine leukemia virus）两种反转录酶。AMV来源于禽成髓细胞瘤病毒，最适反应温度在42℃，具有较强的反转录活性和RNase-H活性， RNase H是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链，从而限制了cDNA的合成长度。 与之对应的m-mlv该酶基因来源于莫洛尼氏小鼠白血病病毒，在具有较强的反转录活性的同时，却具有较低的RNase-H活性，所以它可以获得较长的cDNA片段。因此目前m-mlv应用最广。

  但是这并没有说明m-mlv就是完美的，由于的它的扩增能力有限，一般获得的cDNA片段长度不超过6KB，不足以满足构建cDNA片段，同时该酶的热稳定性较差，50℃时半衰期很短，无法通过提高反应温度克服RNA的二级结构，因此当遇到有复杂结构的RNA时，反转录酶就会从模板上掉下来，反转录失败。如何通过基因工程的方法提高m-mlv的反转录活性，降低RNase-H活性，提高酶的热稳定性，已成为生物公司的研发热点之一。

  有着雄厚研发能力的北京百泰克生物技术有限公司，一直致力于优良性能的反转录酶的研发工作，在不懈的努力下终于在2011年年初迎来了突破性进展。我们经过对m-mlv基因多次定点突变，使该酶的性质得到了质的飞跃！消除了该酶的RNase-H活性，增加了反转录酶与模板的结合能力，增强了酶的延伸活性，从而很到程度上提高了酶的扩增速度，最大可以获得超过15kb的cDNA片段，充分满足了构建cDNA文库的要求；不仅如此，我们研发的反转录酶耐热性显著增强，最适合反应温度50℃，在42℃-55℃范围内拥有最高活性的80%以上，最高反应温度可达60℃，因此可以轻松克服模板RNA的二级结构，顺利完成反转录实验。其性能已经达到行业领先的水平，以下是我们公司与其他公司的反转录酶做的一些对照实验：

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图1 以小鼠总RNA为模板，反转录温度42℃,PCR扩增基因为小鼠Cpt1a基因（1569-3567）,a1、a2某知名公司m-mlv，b1、b2百泰克公司m-mlv supermo (200U，货号PR6811),c1、c2百泰克公司m-mlv super III (200U，货号PR6811),d1、d2某知名品牌产品

 

图2以小鼠总RNA为模板，反转录温度50℃，PCR扩增基因为小鼠Cpt1a基因（1569-3567），a1、a2百泰克公司supermo III (200U，货号PR6811，b1、b2某知名公司产品,c1、c2某知名品牌产品

图3以小鼠总RNA为模板，反转录温度55℃，PCR扩增基因为小鼠Cpt1a基因（1569-3567），a1、a2某知名公司产品，b1、b2, 百泰克公司m-mlv supermo III (200U，货号PR6811)， c1、c2 某知名品牌产品

 
图4以小鼠总RNA为模板，
以小鼠总RNA为模板，反转录温度50℃，PCR扩增基因为小鼠Cpt1a基因（69-4042 ） ，a1、a2某知名公司产品， b1、b2, 百泰克公司m-mlv supermo III (200U，货号PR6811)c1、c2某知名品牌产品

 

之二 无细菌核酸污染的新型反转录酶

  常见的反转录酶主要有，AMV（avian myeloblastosis virus）和m-mlv（molomey murine leukemia virus），耐热真菌分泌的翻转酶等，市场上以前两种反转录酶为主。目前这两种商品化的反转录酶都是来源于大肠杆菌表达的重组酶，经过一定的纯化方法后去除了大肠杆菌本身的杂蛋白后制得。虽然蛋白的纯度较高，但是仍会有少量大肠杆菌的核酸污染，当RNA来自真核生物时，由于种系亲缘关系很远，反转录酶中污染的少量大肠杆菌一般不会影响扩增。但是当RNA来自原核生物尤其是肠杆菌属时，由于亲缘关系很近，此时反转录酶中污染的少量大肠杆菌核酸便会导致假阳性扩增，从而对正常的扩增产生致命的影响，很多研究原核RNA反转录和荧光定量的学者们深深地被这个问题困扰着，他们迫切希望能找到一种无大肠杆菌核酸污染的反转酶。

  针对这样的问题，有着雄厚研发能力的北京百泰克生物技术有限公司，经过反复试验摸索，终于开发一套独特的制备反转酶的方法，采用该方法制备的反转录酶中不含有大肠杆菌自身的核酸片段，以此反转录酶为模板，用大肠杆菌16s DNA引物为进行PCR扩增，35个循环后荧光定量仪检测无扩增。从而彻底解决了由于大肠杆菌核酸污染，导致实验无法完成的难题。